NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN

LINK DOWNLOAD MIỄN PHÍ TÀI LIỆU "NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN": http://123doc.vn/document/554298-nuoi-cay-bacillus-subtilis-thu-nhan-amylase-va-ung-dung-trong-san-xuat-dextrin.htm

v
ABSTRACT

NGUYEN THANH THUY, Nong Lam University of HCM city
Graduating thesis topic: “α-amylase production by Bacillus subtilis solid state
fermentation and dextrin production application”. This thesis was carried out at
biochemistry and application room of Natural Science University HCMC from
03/2007 to 09/2007.
We used α-amylase activity measurement method (Heinkel) and protein
concentration determination method (Lowry) to investigate fermentation time, α-
amylase precipitation by 96% ethanol and solid ammonium sulfate. After
recovering α-amylase from fermented medium we examined starch hydrolysis
ability and dextrin production of α-amylase product.
Result experiments showed that:
- α-amylase activity was hightest at 48h incubation.
- Precipiating α-amylase by 96% ethanol was better than solid ammonium
sulfate and suitable volume ratio of extracted enzyme and ethanol for
precipitation was 1:3.
- Optimum temperature and pH for hydrolysis of purified α-amylase were
respective 55 degree C and 6,0.
- α-amylase had the most effective hydrolysis in 10% cassava starch fluid.


vi
MỤC LỤC

TRANG
Lời cảm ơn iii
Tóm tắt iv
Abstract v
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các hình x
Danh sách các bảng xi
Danh sách các sơ đồ xii
Danh sách các đồ thị xii
Danh sách các biểu đồ xii
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2. MỤC ĐÍCH 2
1.3. YÊU CẦU 2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. BACILLUS SUBTILI 3
2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn 3
2.1.2. Phân loại 6
2.1.3. Bộ gen 6
2.1.4. Ứng dụng 7
2.2. ALPHA-AMYLASE 8
2.2.1. Khái niệm 8
2.2.2. Phân loại, danh pháp 8
2.2.3. Cấu trúc phân tử 8
2.2.4. Tính chất 9
2.2.5. Cơ chế xúc tác 10
2.2.6. Ứng dụng 11
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT 12


vii
2.3.1. Nuôi cấy bề mặt 12
2.3.2. Nuôi cấy chìm 12
2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME 13
2.5. DEXTRIN 13
2.5.1. Phân loại 14
2.5.2. Tính chất 14
2.5.2.1. Độ nhớt 15
2.5.2.2. Độ pH 16
2.5.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin 16
2.5.2.4. Độ hòa tan 16
2.5.2.5. Màu sắc 16
2.5.3. Quy trình sản xuất dextrin 17
2.5.4. Ứng dụng 18
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 19
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 19
3.3. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 20
3.3.1. Xác định mật độ tế bào 20
3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy thích hợp 20
3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% 20
3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH
4
)
2
SO
4
21
3.3.5. Khảo sát thời gian tủa enzyme bằng cồn 96% 21
3.3.6. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân của
α-amylase 22
3.3.6.1. Nhiệt độ 22
3.3.6.2. pH 22
3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn thích hợp thu dextrin 22
3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân của chế phẩm α-amylase với các
nguồn tinh bột. 22
3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột 22
3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp. 23
3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 23


viii
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY 24
4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ
(NH
4
)
2
SO
4
25
4.2.1. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% 24
4.2.2. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH
4
)
2
SO
4
27
4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA ENZYME BẰNG CỒN 96% 28
4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ
NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE 29
4.4.1. Nhiệt độ 29
4.4.2. pH 30
4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN THÍCH HỢP THU DEXTRIN 31
4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA CHẾ PHẨM
α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT 32
4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN
THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE 32
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
PHỤ LỤC


ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B. subtilis Bacillus subtilis
GH Glycosidic Hydrolase
EC Enzyme Commission
DAP Diamoni Phosphate
MW Molecular Weight
Da Dalton
DE Dextrose equivalent
CT Canh trƣờng
dOD Delta optical density
DCE Dịch chiết enzyme
CPE Chế phẩm enzyme (đã sấy khô)
CP tƣơi Chế phẩm enzyme tƣơi
UI Unit International






x
DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Hình thái Bacillus subtilis 3
Hình 2.2. Bacillus subtilis đang trong giai đoạn tạo bào tử 4
Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa 4
Hình 2.4. Cấu trúc không gian của α-amylase 9
Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột 11
Hình 2.5. Dextrin 14
Hình 4.1. Môi trƣờng bán rắn trƣớc khi nuôi cấy 25
Hình 4.2. Canh trƣờng nuôi cấy sau 48 giờ 25
Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase 30
Hình 4.4. Chế phẩm α-amylase 36
Hình 4.5. Chế phẩm dextrin 36








xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis 5
Bảng 2.2. phân loại của Bacillus subtilis 6
Bảng 2.3. Một số tính chất của dextrin 15
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase 24
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase 26
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH
4
)
2
SO
4
lên hoạt độ α-amylase 27
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase 28
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase 29
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase 30
Bảng 4.7. Lƣợng dextrin thu đƣợc ở các tỷ lệ cồn 96% 31
Bảng 4.8. Dextrin tạo thành do α-amylase thủy phân tinh bột 10% 32
Bảng 4.9. Hiệu suất thu dextrin 33
Bảng 4.10. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 10% 33
Bảng 4.11. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 15% 34
Bảng 4.12. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 20% 35






















xii
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột 17

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase 25
Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase 26
Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH
4
)
2
SO
4
lên hoạt độ α-amylase 27
Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase 28
Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase 29
Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase 31

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 4.1. Lƣợng dextrin thu đƣợc từ các tỷ lệ cồn 96% 31
Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ tinh bột 10% 32
Biểu đồ 4.3. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 10% 34
Biểu đồ 4.4. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 15% 34
Biểu đồ 4.5. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 20% 35


1


Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, α-amylase là một trong những enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán
bệnh…Trong công nghiệp thực phẩm, α-amylase đóng vai trò đặc biệt quan trọng.
Thông qua sự thủy phân tinh bột, α-amylase tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh
dƣỡng nhƣ dextrin, maltose, glucose…
Trƣớc đây, ngƣời ta thu nhận α-amylase từ malt là chủ yếu. Ngày nay, với
nền công nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhu cầu về α-amylase tăng cao nên việc
áp dụng những kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy vi sinh vật để thu dễ dàng hơn với
lƣợng lớn α-amylase là rất cần thiết.
Dextrin là sản phẩm do sự thủy phân tinh bột của α-amylase. Ngoài giá trị
dinh dƣỡng, dextrin còn là một trong những yếu tố cải thiện tính chất, cảm quan của
thực phẩm. Vì vậy, dextrin ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến trong chế biến thực
phẩm và công nghiệp bánh kẹo.
Sản xuất dextrin từ tinh bột có thể dùng acid hay enzyme. Tuy nhiên, sản
xuất dextrin bằng acid có rất nhiều hạn chế là khó định hƣớng sản phẩm do tác dụng
không đặc hiệu của acid lên nguyên liệu, độc hại nên đòi hỏi phải có trang thiết bị
đắt tiền, lƣợng acid dƣ gây hƣ hỏng thiết bị và làm ô nhiễm môi trƣờng. Mặc khác,
dextrin thành phẩm có màu và vị đắng.
Việc sử dụng α-amylase thay thế cho acid trong các qui trình sản xuất
dextrin sẽ khắc phục đƣợc những hạn chế trên.


2
Dextrin thu đƣợc nhờ α-amylase sau khi sấy phun có màu trắng, pH trung
tính, ít ngọt, sạch khuẩn, khoáng và chất hữu cơ nên rất thích hợp sử dụng trong
nhiều ngành công nghiệp và trong y dƣợc.
Từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu
nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin”.
1.2. MỤC ĐÍCH
Thu nhận α-amylase, xác định điều kiện tối ƣu cho phản ứng thủy phân của α-
amylase và tinh bột để thu nhận dextrin.
1.3. YÊU CẦU
- Khảo sát thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trƣờng bán rắn ở
điều kiện nuôi cấy theo đề tài nghiên cứu trƣớc.
- Thu nhận và tinh sạch sơ bộ α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy B.subtilis.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân tinh bột tạo
dextrin của chế phẩm α-amylase.