tomato yellow leaf curl virus resistance in solanum lycopersicum through transgenic approaches

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ZUSAMMENFASSUNG III
Zusammenfassung


Das Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Familie Geminiviridae (Gattung:
Begomovirus), stellt weltweit, vor allem aber in den Tropen und Subtropen, ein ernsthaftes
Problem in der Tomatenproduktion dar, wobei es erhebliche wirtschaftliche Verluste
verursachen kann. Eine Möglichkeit, um TYLCV wirkungsvoll zu bekämpfen, stellen
resistente Tomatensorten dar. Fast alle im Handel erhältlichen Tomatensorten sind jedoch
anfällig für TYLCV und Resistenzgene für Züchtungsprogramme finden sich
hauptsächlich in Wildtyp-Tomaten. Gentechnische Ansätze könnten eine mögliche Lösung
für die Etablierung von Resistenzen gegenüber Viren liefern. Diese Arbeit hatte zum Ziel
ein Transformationssystem für Solanum lycopersicum zu optimieren, um damit transgene
Tomatenpflanzen mit einer Resistenz gegen TYLCV über ein Gen-Silencing-Konzept
(RNA-Interferenz, RNAi) zu entwickeln.

Die Arbeiten konzentrierten sich zunächst auf die Optimierung des
Transformationsprotokolls von Blattmaterial verschiedener kommerzieller Tomatensorten
aus Vietnam unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens EHA105 mit dem
Helferplasmid pSoup und pGreenII als Vektor für das zu transformierende Gen. Ein
effizientes System zur Transformation hängt von der effektiven Regeneration und einer
effektiven Methode für die Einführung fremder Gene in die Pflanzenzellen ab. Die
Optimierung der Nährmedien und der Bedingungen für die Regeneration von vier
Tomatensorten erfolgte mit Glucuronidase (gus) als Markergen. Die Versuche zeigten,
dass Phytohormone (trans-Zeatin und Indolylessigsäure; IAA) einen Effekt auf die
Kompetenz der Zellen für die Transformation ausübten. Die Zugabe von trans-Zeatin und
IAA in die Vorkulturmedien, während der Inokulationsphase und in die Co-Kultur Medien
führte zu einer höheren Transformationsfrequenz und eine stärkeren GUS-Expression. Auf
die Transformation hatten die Temperatur während der Inokulation und der Co-Kultur
sowie die Konzentration von A. tumefaciens die stärksten Einflüsse. Darüber hinaus
zeigten die Versuche auch, dass die Agrobacterium-Inokulation eine zusätzliche Belastung
für die Regeneration der Explantate darstellte, so dass eine Verbesserung der Glufosinat-
Selektion nötig wurde, um zu einem optimierten Protokoll für die Tomatentransformation
mittels pSoup / pGreenII zu gelangen.

ZUSAMMENFASSUNG IV
Zwei als inverted-repeat angeordnete Regionen der DNA-A des Tomato yellow leaf curl
Thailand virus (TYLCTHV) wurden zur Transformation und Regeneration von Solanum
lycopersicum var. FM372C verwendet, um RNAi gegen das TYLCV zu erzielen. Das erste
Konstrukt umfasst die sogenannte „Intergenic region“ einschließlich eines Teils des Gens
für das replikationassoziierte Protein (IR/Rep), während das zweite Konstrukt Teile des
Pre-Hüllprotein- und Hüllproteingens (Pre/Cp) enthält. Die unabhängigen transgenen (To)
Pflanzen wurden auf das Vorhandensein des jeweiligen Transgens mittels PCR und
Southern-Blot-Analysen überprüft. Die T1-transgenen Pflanzen wurden im 5-7 Blatt-
Stadium erneut durch PCR auf die Präsenz von IR/ Rep bzw. auf Pre/Cp geprüft, bevor die
Pflanzen entweder mit TYLCTHV DNA-A und DNA-B bzw. mit Tomato yellow leaf curl
Vietnam virus (TYLCVV) agroinokuliert wurden. Die Symptome wurden bonitiert und das
Auftreten der Viren durch PCR und ELISA bestimmt. Frühe Symptome, wie Gelbfärbung
der Blätter und Blattrollen in nicht-transgenen und anfällig reagierenden transformierten
Pflanzen traten 3 Wochen nach Inokulation auf. Mit Fortschreiten der Erkrankung kam es
zu schweren Symptomen, die charakteristisch für die TYLCV Krankheit waren. In
mehreren Pre/Cp transgenen Linien wurde eine Toleranz gegen das TYLCTHV, nicht aber
gegen das TYLCVV gefunden. Eine Linie der IR/Rep transgenen Pflanzen reagierte mit
Immunität auf die Inokulation mit TYLCTHV und TYLCVV. Die Ergebnisse zeigen, dass
mit inverted-repeat Konstrukten Toleranz bzw. Resistenz auch gegen Geminiviren erzielt
werden kann.

Stichworte: Transformation, Solanum lycopersicum, TYLCV, RNAi, Resistenz


TABLE OF CONTENTS V
TABLE OF CONTENTS
ABSTRACT…………………………………………………………………………………I
ZUSAMMENFASSUNG………………………………………………………………….III
TABLE OF CONTENTS………………………………………………………………… V
ABBREVIATIONS……………………………………………………………………… IX
CHAPTER 1
General information
1.1 General introduction……………………………………………………………………1
1.2 Literature review……………………………………………………………………… 5
1.2.1 Tomato yellow leaf curl virus – Taxonomy………………………………………… 5
1.2.2 Begomoviruses-genome structure………………………………………………… 6
1.2.2.1 The intergenic region - promoters and transcription……………………………… 8
1.2.3 Viral proteins……………………………………………………………………… 9
1.2.3.1 The coat protein…………………………………………………………………… 9
1.2.3.2 The precoat protein……………………………………………………………… 10
1.2.3.3 The replication associated protein (REP) …………………………………………10
1.2.3.4 The replication enhancer protein (REn)………………………………………… 11
1.2.3.5 The transcriptional activator protein (TrAP)………………………………………11
1.2.3.6 The AC4/C4 protein……………………………………………………………….12
1.2.3.7 The movement proteins (BC1 and BV1)………………………………………… 12
1.2.3.8 Beta satellites and the βC1 protein……………………………………………… 12
1.2.4 Infection cycle of begomovirus…………………………………………………… 13
1.2.4.1 Begomovirus transmission……………………………………………………… 13
1.2.4.2 Infection cycle in plants………………………………………………………… 14
1.2.5 Resistance breeding through transgenic approaches……………………………… 16
1.2.5.1 Pathogen-derived resistance through the expression of viral proteins…………….17
1.2.5.1.1 REP-mediated resistance……………………………… ……………………….17
1.2.5.1.2 Coat protein-mediated resistance……………………………………………… 18
1.2.5.1.3 Movement protein-mediated resistance…………………………………………19
1.2.5.2 RNA/DNA-mediated resistance………………………………………………… 19
1.2.5.2.1 Post-transcriptional gene silencing (PTGS) ……………………………………19
TABLE OF CONTENTS VI
1.2.5.2.2 Antisense RNA……………….…………………………………………………21
1.2.5.2.3 Defective interfering DNA (DI)………….…………………………………… 22
1.2.5.3 Expression of non-pathogen derived antiviral agents…………………………… 23
1.2.5.3.1 Trans-activation of a toxic protein……… …………………………………….23
1.2.5.3.2 Expression of DNA binding proteins… ……………………………………….23
1.2.5.3.3 A Chaperonin (GroEL) ……………………………………………………… 24
1.2.5.3.4 Peptide aptamers……………………………………………………………… 24
1.2.6 Gene silencing via RNAi…………………………………………………………….25
1.2.7 Tomato transformation………………………………………………………………28
1.3 Aims and significance of the study……………………………………………………31
CHAPTER 2
Development of a simple and effective protocol for leaf disc
transformation of commercial tomato cultivars via Agrobacterium
tumefaciens
2.1 Introduction……………………………………………………………………………33
2.2 Materials and methods……………………………………………………………… 34
2.2.1 Materials…………………………………………………………………………… 34
2.2.2 Method of optimising for shoot regeneration ……………………………………….35
2.2.3 Methods of optimising conditions for transformation……………………………….35
2.2.4 Development of the transformation process…………………………………………36
2.2.5 Experimental design and data analysis………………………………………………37
2.3 Results ……………………………………………………………………………… 37
2.3.1 Optimising shoot induction from leaf explants…………………………………… 37
2.3.2 Effect of Agrobacterium cell density on transformation frequencies……………….38
2.3.3 Effect of temperature during inoculation and co-culture on transformation
frequencies……………………………………………………………………………… 40
2.3.4 Effect of plant phytohormones during inoculation and co-cultivation on
transformation frequencies……………………………………………………………… 41
2.3.5 Determining the critical concentration of glufosinate on callus and root induction 43
2.3.6 Establishment of a full transformation process …………………………………… 46
2.4 Discussion…………………………………………………………………………… 47
TABLE OF CONTENTS VII
CHAPTER 3
The inverted-repeat hairpinRNA derived from intergenic region and Rep
gene of TYLCTHV confers resistance to homologous and heterologous
viruses
3.1 Introduction……………………………………………………………………………54
3.2 Materials and methods……………………………………………………………… 55
3.2.1 Transformation of plants…………………………………………………………….55
3.2.1.1 Bacterial system and vectors………………………………………………………55
3.2.1.2 RNAi constructs (self-complementary hairpin RNA constructs)…………………55
3.2.1.3 Plant transformation procedure and anlayses of transgenic plants……………… 56
3.2.1.4 Plant DNA isolation……………………………………………………………….56
3.2.1.5 Polymerase chain reaction (PCR)………………………………………………….57
3.2.1.6 Southern hybridization…………………………………………………………….58
3.2.2 Evaluation of plants resistance in transgenic plants……………………………… 59
3.2.2.1 Plant material…………………………………………………………………… 59
3.2.2.2 Virus agroinoculation…………………………………………………………… 59
3.2.2.3 Evaluation of virus symptoms…………………………………………………… 60
3.2.2.4 Confirmation of virus presence by PCR………………………………………… 62
3.3 Results…………………………………………………………………………………63
3.3.1 Confirmation of successful transformation via PCR……………………………… 63
3.3.2 Seed production from To plants…………………………………………………… 64
3.3.3 Identification of transgene copy number in transformed plants…………………… 64
3.3.4 TYLCTHV resistance tests in T
1
plants transformed with the IR/Rep-hpRNA
construct………………………………………………………………………………… 68
3.3.4.1 Agroinoculation of Nicotiana benthamiana with TYLCTHV and TYLCVV…….68
3.3.4.2 Agroinoculation of transgenic tomato plants with TYLCTHV……………………69
3.3.4.3 TYLCTHV detection by PCR…………………………………………………… 72
3.3.4.4 Molecular characterization of transgene in immunity plants by Southern
hybridization……………………………………………………………………………….74
3.3.4.5 Agroinoculation of transgenic tomato plants with TYLCVV…………………… 75
3.4 Discussion ……………………………………………………………………………77
TABLE OF CONTENTS VIII
CHAPTER 4
Inverted-repeat hairpinRNA derived from a truncated pre-coat/coat-
protein gene of TYLCTHV confers resistance in transgenic tomato plants
4.1 Introduction……………………………………………………………………………80
4.2 Materials and methods……………………………………………………………… 81
4.2.1 RNAi construct …………………………………………………………………… 81
4.2.2 Evaluation of virus resistance in transgenic tomato…………………………………82
4.2.3 Triple antibody sandwich (TAS) ELISA for detection of TYLCV…………………83
4.3 Results…………………………………………………………………………………84
4.3.1 Results of transformation……………………………………………………………84
4.3.1.1 Confirmation of successful transformation via PCR………………………… 84
4.3.1.2 To

seed production……………………………………………………………… 86
4.3.1.3 Detection of transgene copy number by Southern Blot analyses………………….86
4.3.2 Evaluation of TYLCTHV and TYLCVV resistance……………………………… 91
4.3.2.1 Resistance tests for Tomato yellow leaf curl Thailand virus…………………………91
4.3.2.2 TYLCTHV detection by PCR ………………………………………………… 95
4.3.2.3 TYLCTHV coat protein detection by ELISA……….………………………… 96
4.3.3 Resistance test for Tomato yellow leaf curl Vietnam virus…………………………… 97
4.4 Discussion…………………………………………………………………………… 98
GENERALDISCUSSION……………………………………………………………… 102
REFERENCES………………………………………………………………………… 111
APPENDIX…………………………………………………………………………… 137
ACKNOWLEDGEMENT…………………………………………………………….….139
STATEMENT………………………………………………………………………… 141




ABBREVIATION IX
ABBREVIATIONS

g
h
mg
ml
mM
μM
μl
ppm
L
%
°C
aa
bp
BCM
CP
cp
CR
cv.
dpi
DNA
dNTPs
dsDNA
dsRNA
DMSO
DSMZ
EDTA
ELISA
e35S CaMV

Gram
Hours
Milligram
Milliliter
Millimolar
Micromolar
Microliter
Part per million
Liter
Percent
Degree Celsius
Amino acid
Base pair
Basic culture medium
Coat protein
Gene encoding coat protein
Common region of geminivirus genome
Cultivar
Days past inoculation
Deoxyribonucleic acid
Mix of the four deoxynucleotide triphosphates
Double stranded DNA
Double stranded RNA
Dimethylsulfoxid
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
Ethylenediaminetetraacetic acid
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Enhanced 35S CaMV promoter



ABBREVIATION X
ER
GUS
hpRNA
IAA
IR
Kb
LB
MES
MP
miRNA
mRNA
MS
NES
NLS
nptI
nt
nd
NTP
PD
NPC
OD
600
ORF
P
PAZ-domain
bar
PCNA
PCR
PDR
pH
PIWI-domain
Pmol
PTGS

Endoplasmic reticulum
β-Glucuronidase
Hairpin RNA
Indolacetic acid
Intergenic region
Kilobase
Left border
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
Movement protein
Micro RNA
Messenger RNA
Murashige and Skoog media
Nuclear export signal
Nuclear localization signal
Bacterial kanamycin resistance gene
Nucleotide
Not ditermined
Nucleoside triphophate
Plasmodesmata
Nuclear pore complex
Optical density measured at 600 nm
Open reading frame
Statistical probability value
Binding domain in Argonaute and Dicer family protein
Basta resistance gene
Proliferating cell nuclear antigen
Polymerase chain reaction
Pathogen-derived resistance
Negative decade logarithm of hydrogen ion concentration
A domain of Argonaute protein
Picomolar
Post-transcriptional gene silencing
ABBREVIATION XI

RAPD
RB
RC
RdDM
RdRp
REP
Rep
RISC
rpm
RNA
RNAi
RT
ssDNA
ssRNA
AZPs
siRNA
ST-LS1
TAE
TAS-ELISA
T
DNA
TGS
T-Rep
To
T
1
vir gene
wt
X-Gluc
Zea
Random amplification polymorphic DNA
Right border
Rolling circle
RNA-directed DNA methylation
RNA-dependent RNA polymerase
Replication-associated protein
Gene encoding replication-associated protein
RNA-induced silencing complex
Revolutions per minute
Ribonucleic acid
RNA interference
Room temperature
Single strand DNA
Single strand RNA
Artificial zinc-finger proteins
Short interfering RNA
Intron from the ST-LS1 gene of potato
Tris-acetate-EDTA
Triple-Antibody-Sandwich ELISA
Transferring DNA
Transcriptional gene silencing
Truncated Rep gene
First regeneration of transformed plants obtained from transformation
Progenies of To
Virulence genes of Agrobacterium tumefaciens
Wild type
5-bromo-4-chloro-3-indoly-glucoronide
Trans-zeatin


CHAPTER 1 1
CHAPTER 1
General information
1.1 General introduction
Vegetables cultivated in tropical and subtropical regions are commonly influenced by
different diseases including virus diseases. Currently, viruses from three important genera,
including Potyvirus, Begomovirus, and Tospovirus, cause a severe decrease in crop yields
worldwide (Rybicky et al., 1999). One important affected vegetable is cultivated tomato
(Solanum lycopersicum, formerly known as Lycopersicum esculentum) which belongs to
the Solanaceae family (Rick, 1960).
Among the geminiviruses, Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), which belongs to the
genus Begomovirus, influences tomato production in many tropical and subtropical regions
and causes yield reduction up to total loss of the crop (Pico et al., 1996; Czosnek and
Laterrot, 1997). Tomato yellow leaf curl disease has long been known in the Middle East,
North, and Central Africa, as well as in Southeast Asia. The disease has spread to Southern
Europe, the Caribbean region and the United States resulting in a worldwide distribution
(Figure 1). Therefore, the disease causes economically important problems for tomato
production around the world (Pico et al., 1996; Czosnek and Laterrot, 1997; Moriones et
al., 2000).
The traditional management methods to prevent TYLCV diseases depend on controlling
the vector transmitting the viruses (whiteflies). However, control is difficult due to the very
wide host range and the complex interrelationships among virus, host, vector, virus source
and environment. To date, insecticidal spraying is the most frequently used method to
control the vectors. Nevertheless, chemical treatments are very often only partially
effective and can cause adverse environmental effects. Thus, one of the best ways to
eliminate the yield losses due to viruses is to develop tomato varieties that are resistant or
tolerant to a given virus.