Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật Elisa và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
….  ….











PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA
VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH
CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR























Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 / 2006
Sinh viên thực hiện:
NGUYỄN ANH KHOA
Giáo viên hƣớng dẫn:
PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN


iii


LỜI CẢM ƠN

 Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
 PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện
thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này.
 TS. Bùi Minh Trí đã chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức trong thời gian thực
hiện đề tài.
 ThS. Nguyễn Văn Cƣờng cùng các anh chị trong Trung tâm Phân tích
Thí nghiệm Hóa Sinh – trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
 ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng Bến Cát đã giúp
đỡ tôi trong quá trình thu mẫu tại đây.
 Xin chân thành cảm ơn đến quí Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã
nhiệt tình chỉ dạy cũng nhƣ đóng góp ý kiến chân thành cho tôi trong suốt thời
gian làm khóa luận này.
 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã luôn ủng hộ,
động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Sinh viên thực hiện


Nguyễn Anh Khoa





iv


TÓM TẮT
NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2006.
“PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC
ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT
PCR”
Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến.
Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc
(Ratoon stunting disease) đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng
(TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. Đây là nghiên
cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên
một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này. Đặc biệt đề tài là
bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia
xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra trên cây mía ở nƣớc ta bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu
góp phần quan trọng trong công tác tuyển chọn giống sạch bệnh cũng nhƣ công tác
phòng chống và kiểm soát dịch bệnh trên cây có mía hiệu quả hơn.
Kết quả đạt đƣợc
- Các giống mía sản xuất và nhập nội đƣợc khảo sát đều không bị nhiễm bệnh
khảm lá mía thông qua kết quả chẩn đoán bằng ELISA.
- Phát hiện đƣợc bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi
và nhuộm mô mẫu. Kết quả: tỉ lệ mô khoẻ mạnh trên các giống mía khảo sát tại
TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trƣờng Thọ vực là 75,18%.
- Xác định sơ bộ các nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx.
- Đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn Lxx và hoàn thiện quy trình phát hiện
vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR.


v


SUMMARY

This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the
thesis on 9
th
2006. The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by
ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ”.
Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some
sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh
Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai. That is basic to contribute statistics to
situation of sugarcane mosaic disease at the areas. Specially, the thesis is the first step
to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) on
sugarcane in our country. The researching is an important contribution to select
pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane
effectively.
The results of this research are as follows:
- DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species
produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not
found SCMV.
- Detecting Lxx by microscopy and STM stainning. Results: 70,5% of phloem
vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and
75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm.
- Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process.
- Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria
detecting process by PCR.




vi


MỤC LỤC

Nội dung Trang
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi
Phần 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2
1.3. Giới hạn đề tài 2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lƣợc về cây mía 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện 3
2.1.2. Phân loại 3
2.1.3. Nguồn gốc và phân bố 3
2.1.4. Nhân giống 4
2.1.5. Sản lƣợng 4
2.1.6. Chế biến và sử dụng 5
2.2. Bệnh trên cây mía 5
2.3. Bệnh khảm lá mía 7
2.3.1. Nguồn gốc và phân bố 7
2.3.2. Triệu chứng 7
2.3.3. Tác nhân gây bệnh 8
2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía 9
2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh 9
2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế 9
2.3.7. Phòng trừ 10
2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía 10


vii


2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh 10
2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi 10
2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) 10
2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 12
2.4. Bệnh cằn mía gốc 14
2.4.1. Nguồn gốc và phân bố 14
2.4.2. Triệu chứng 14
2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài 14
2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây 15
2.4.3. Tác nhân gây bệnh 16
2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh 16
2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế 17
2.4.6. Kiểm soát bệnh 17
2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía 17
2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi 17
2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học 17
2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) 19
2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử 19
2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc 19
2.5.1. Trên thế giới 19
2.5.2. Trong nƣớc 20
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
3.1. Nội dung nghiên cứu 22
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22
3.3. Vật liệu nghiên cứu 22
3.3.1. Các giống mía nghiên cứu 22
3.3.2. Virus gây bệnh 22
3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh 22
3.3.4. Hóa chất thí nghiệm 23
3.3.5. Thiết bị và dụng cụ 23
3.4. Phƣơng pháp tiến hành 23
3.4.1. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu 23


viii


3.4.2. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA 24
3.4.3.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm 24
3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA 26
3.4.3. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng 27
3.4.4. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng phƣơng
pháp nhuộm STM 27
3.4.5. Phƣơng pháp nuôi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx 28
3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx 29
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA 31
4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR 32
4.2.1. Điều tra sự nhiễm bệnh cằn mía gốc dựa vào triệu chứng. Phát hiện vi
khuẩn Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp
nhuộm STM. 32
4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx
và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy 36
4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx 37
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41
5.1. Kết luận 41
5.2. Đề nghị 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
PHỤ LỤC xii


ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

BẢNG TRANG
Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh. 6
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt 30
Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp
quan sát dƣới kính hiển vi 34
Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại
TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp nhuộm STM. 35
Bảng 4.3. So sánh kết quả chẩn đoán của hai phƣơng pháp:
dùng kính hiển vi và nhuộm STM. 36
Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp 11
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT - PCR 13
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra 24
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA 25
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA 25


x


DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Cây mía 3
Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên cây mía 6
Hình 2.3. Triệu chứng bệnh khảm lá mía 7
Hình 2.4. Sugarcane mosaic virus 8
Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA 12
Hình 2.6. Lxx gây những vết chuyển màu ở thân mía. 15
Hình 2.7. Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli dƣới kính hiển vi điện tử
(x30.000 lần) (K. E. Damann, 2002). 16
Hình 4.1. Kết quả chẩn đoán SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA. 32
Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) 34
Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi
(x 40 lần (A) và x 100 lần (B)). 35
Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng
sau 2 ngày nuôi cấy (A); và khuẩn lạc của nó sau khi phân lập (B). 36
Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu. xvi
Hình PL2. Lá mía có triệu chứng khảm. xvi
Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích ELISA. xvi
Hình PL4. Bệnh đốm vòng thƣờng xuất hiện trên các cây khảo sát. xvi
Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu. xvi
Hình PL6. Gốc mía bị cằn. xvi
Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên ngắn lại. xvii
Hình PL8. Thân mía bị bệnh có đƣờng kính nhỏ hơn thân bình thƣờng. xvii
Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân. xvii


xi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ELISA: enzym linked immunosorbent assay.
DAS-ELISA: double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay.
TTNCMĐ: Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng.
RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction.
cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid.
ctv: Cộng tác viên.
NCM: Màng nitrocellulose
ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate.
DEPC: Diethyl pyrocarbonate.
dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate.
p-NPP: p - nitrophenol phosphate.
PVP: Polyvinylpyrrolidone.
BSA: Bovine serum albumin.
PBS: Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 và sodium azide.
RNA: Ribonucleic acid.
bp: Base pair.
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid.
mRNA: Messenger RNA.
PCR: Polymerase chain reaction.
RNase: Ribonuclease.
SCMV: Sugarcane Mosaic Virus.
RSD: Ratoon stunting disease.
Lxx: Leifsonia xyli subsp. xyli.
STM: Stainning transpiration.
TTPT: Trung tâm phân tích.
Taq: Thermus aquaticus.

Xem chi tiết: Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật Elisa và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR